NNRTI-induzierte Resistenzmutationen im HIV-Genom

Jährlich werden weltweit 700 000 Kinder mit HIV/AIDS infiziert, meist durch vertikale Transmission in Subsahara-Afrika. Wenn überhaupt steht in den infrastruktuell schwachen Regionen Subsahara-Afrikas zur Verminderung der HIV Mutter-Kind-Übertragung nur die antiretrovirale Prophylaxe mit dem Medikament Nevirapin zur Verfügung. In Uganda wurde eine Forschungskohorte mit etwa 100 Mutter-Kind-Paaren aufgebaut. Diese Mutter-Kind-Paare wurden seit der Einnahme von Nevirapin zu regelmäßigen Zeitpunkten über 18 Monate nachuntersucht und Körpersekrete (Blut, Brustmilch, Vaginalsekrete, Oropharyngealsekrete) wurden abgenommen.

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Projektinhalte

Nevirapin gehört zur Klasse der nichtnukleosidalen Reverse Transkriptase Inhibitoren (NNRTI) und birgt das Risiko der raschen Resistenzbildung. Mögliche Implikationen sind die Übertragung von resistentem Virus auf das Kind und ein vermindertes Ansprechen auf eine Langzeit-HIV-Therapie mit Substanzen der NNRTI-Gruppe.

Vor dem Hintergrund der Auswirkungen der Nevirapin-Prophylaxe auf eine Langzeittherapie sollen in diesem Forschungsvorhaben NNRTI-assoziierte Resistenzmutationen des HIV-Genoms in den Kompartimenten Blut von Mutter und Kind und Brustmilch nach Nevirapin-Prophylaxe analysiert werden. Spezifische Fragestellungen betreffen die Entstehung und zeitliche Entwicklung von Mutationen in der HIV-RNA in Blut und Brustmilch, die Übertragung von resistentem Virus auf das Kind und der Einfluss von Höhe und Verlauf der Nevirapinkonzentrationen auf die Resistenzbildung bei Mutter und Kind.

Dazu wurden erfolgreich zwei allele-spezifische real-time PCRs zum hoch-sensitiven Nachweis von definierten Nevirapin-Mutationen am Lightcycler 480 etabliert. Die entwickelten Methoden sind in der Lage, die in Uganda am häufigsten verbreiteten HIV-Subtypen A, C und D zu detektieren. Die Sensitivität der Methoden ist so groß, dass minoritäre Varianten detektiert werden können, die weniger als 1% der Gesamtpopulation ausmachen. Die beiden am häufigsten auftretenden Nevirapin-assoziierten Mutationen, die K103N-Mutation und die Y181C-Mutation können damit erfasst werden. Die Nachweisgrenze für die K103N-Mutation liegt bei 0.019% für das Codon AAC und bei 0.013% für das Codon AAT bzw. bei 0.17% im Falle der Y181C-Mutation.

Nach Etablierung der allele-spezifischen real-time PCRs wurden Blutproben korrespondierender ugandischer Mutter-Kind Paare von der Geburt und 2, 6, 12, 26, 52 und 78 Wochen danach auf das Vorliegen der beiden Mutationen K103N und Y181C untersucht und diese ggf. quantifiziert. 44% der vertikal mit HIV infizierten Kinder wiesen in wenigstens einer Probe wenigstens eine der beiden Mutationen auf während dies bei 78% der Müttern der Fall war. 66% aller detektierten Resistenzmutationen lagen nur bei weniger als 5% der HI-Viren vor und wären somit von konventionellen Sequenzierungstechniken nicht erfasst worden. Den höchsten Mutantenanteil an der Gesamtpopulation ließ sich bei den Kindern nachweisen, die bereits im Mutterleib (in-utero) mit HIV angesteckt wurden. Keines der erst postnatal über die Muttermilch infizierten Kinder wies eine der beiden Mutationen auf. Keine der Kinderproben von Monat 12 oder später, aber 2 der mütterlichen Blutproben wiesen Resistenzmutationen auf.

Zusammenfassen lässt sich sagen, dass die beiden Mutationen K103N und Y181C zwar häufig, aber meist nur in einem kleinen Teil der HI-Viren entstehen. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass die Mutationen in den Kindern häufiger entstehen oder in den Kindern länger persistieren als in ihren Müttern. Unklar ist und daher dringend untersucht werden muss, welche Auswirkungen diese Mutationen bei Kindern auf das Therapieansprechen gegenüber einer späteren, NNRTI-haltigen Langzeit-HIV-Therapie haben.

Um die Ergebnisse der Nevirapinkonzentrationen in den verschiedenen Kompartimenten mit dem Vorliegen von NNRTI-Mutationen korrelieren zu können, sind detaillierte pharmakokinetische Daten der einzelnen Kinder und Frauen notwendig. Da Nevirapin eine sehr lange Halbwertszeit aufweist, haben wir in etwa 60 ugandischen Mutter-Kind Paaren die Nevirapinspiegel im mütterlichem Blut, Brustmilch und kindlichem Blut von der Geburt bis zu 6 Wochen danach gemessen (untere Nachweisgrenze 15 ng/ml). Zur Geburt betrugen die NVP Konzentrationen im Median 1755 ng/mL (mütterliches Blut), 1012 ng/mL (Brustmilch) und 1300 ng/mL (kindliches Blut). 1 Woche nach der Geburt lagen bei allen Proben die NVP-Spiegel >IC50 (10 ng/ml) von Nevirapin (Mediane: mütterliches Blut 164 ng/mL; Brustmilch 114 ng/mL; kindliches Blut 183 ng/mL). Während 2 Wochen nach der Geburt in 51.4% der mütterlichen Blutproben, 56.2% der Brustmilchproben und in 61.3% der kindlichen Blutproben immer noch Nevirapin nachweisbar war, ließ sich in keiner Probe, die 6 Wochen nach der Geburt entnommen worden war, Nevirapin nachweisen.

In Kooperation mit dem Institut für Pharmazie der Universität Halle-Wittenberg (Leitung Frau Professor Kloft) wurden pharmakokinetische Populationsanalysen mittels NONMEM für die Verteilung und die Dauer des Nachweises von Nevirapin nach Einmaleinnahme in den 3 Kompartimenten durchgeführt. Ausgehend davon wurde mittels Simulationsanalysen berechnet, wie lange effektive Nevirapinkonzentrationen vorliegen. Hierbei zeigte sich, dass 80% der Mütter und Kinder für 2-3 Wochen Nevirapinkonzentrationen >IC50 aufweisen.

Da das HIV-Risiko durch das Trinken von Muttermilch für das Kind in der frühen postnatalen Phase besonders hoch ist, bedeuten diese Ergebnisse, dass die hohen und lang nachweisbaren Nevirapinspiegel einen protektiven Effekt auf die frühe postnatale Transmission von HIV haben dürften. Andererseits prädisponiert der lange Zeitraum langsam absinkender Konzentrationen für die Ausbildung von Resistenzen. Bisher wird als Maßnahme zur Verhinderung der Resistenzbildung die zusätzliche Einnahme von  Zidovudin (AZT) und Lamivudin (3TC) für 1 Woche empfohlen. Vor dem Hintergrund unserer Ergebnisse dürfte dies wahrscheinlich eine zu kurze Zeitspanne sein, um die Resistenzbildung durch Nevirapin vollständig verhindern zu können.

Projektdaten

Projektleitung:
Dr. Andrea Kunz

Mitarbeit:
Dr. Andrea Hauser
Prof. Dr. Gundel Harms-Zwingenberger

Kooperation:
Dr. Claudia Kücherer
Robert Koch-Institut Berlin
Institut für Pharmazie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Projektdauer:
2007-2008

Projektstand:
Abgeschlossen

Förderung:
Hector Stiftung

Präsentationen


"Allele-specific, subtype A and subtype D specific real-time PCR for the detection of minor drug-resistant populations after nevirapine single-dose". XVII Internationalen AIDS Konferenz, Mexiko, 2008.

"Detection of minor drug-resistant populations in plasma of HIV-infected children and their mothers after single-dose nevirapine". XVII Internationalen AIDS Konferenz, Mexiko, 2008.

"Population Pharmacokinetics in Black Newborns for Nevirapine to Prevent HIV Transmission". 2nd World Conference on Magic Bullets (Ehrlich II), Nürnberg, 2008.

Poster "Nevirapine - Population pharmacokinetic model building and simulation for mothers and newborns". Page-Meeting, Marseille 2008.

"Population pharmacokinetics of nevirapine for HIV prevention in newborns". Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft, Bonn, 2008.